إعداد العينات للفحص المجهري

1 – عمل مقاطع دقيقة في العينة Thin section

- من شأنها تسهيل نفاذ الضوء

- العينات النباتية والحيوانية هشة
وعند عمل القطاعات قد تتمزق ولإعطائها صلابة ومقاومة للتمزق يجب تجهيزها
قبل الفحص ويتم ذلك بعمل تثبيت للعينة Fixation حيث يعمل عملية مسلخ
للبروتينات Denaturation وتخثير للبروتينات داخل الخلية وبالتالي يتم تثبيت
كل مكونات الخلية ومنع تعرضها للتسيب عند وضع الخلية في محاليل مختلفة عند
تجهيزها للفحص حيث يتم قتل الأنسجة وتثبيتها لمنعها من الخروج من داخل
الخلية .

جميع الأغشية يدخل في تركيبها البروتينات وتعتبر الدهون الفسفورية phosphor lipids هي المركب الأساسي في جميع الأغشية الخلوية .

- من أشهر المواد المثبته هي الكلوروفورم .

-يمكن استبدال عملية المقاطيع الرقيقة
بعملية الهرس أو الدهك كأن نأخذ القمة النامية من الجذر ونضعها في محلول
مثبت ، ثم نضعها في حامض HCL معياري ونضعها بعد ذلك على شريحة زجاجية ثم
نضع غطاء الشريحة ونضغط عليه مما يؤدي إلى هرس الخلايا وتفككها وتتكون
لدينا طبقة واحدة من الخلايا تكون رقيقة . وهذه الطريقة محدودة وتستخدم في
دراسة الكروموزومات والإنقسام الغير مباشر ولكن هذه الطريقة لا تجدي نفعاً
مع جميع المواد .

- بعد عملية التثبيت تجري عملية غسيل
للتخلص من المادة المثبتة ثم نجري عملية تجفيف dehydration للتخلص من
الماء الزائد الموجود في الخلايا ويتم ذلك بإمرار العينة في كحول متدرج
الكثافة ابتداء من 50% إلى 100% .

- بعد ذلك نجري عملية ترويق cleaning لتخليص العينة من باقي الكحول الموجود فيها ويتم ذلك باستخدام الزيلول .

- بعد ذلك نجري عملية طمر في الشمع
حيث يتخلل الشمع بين الخلايا وداخلها وحولها إعطاءها الصلابة ويتم ذلك
باستخدام شمع البرافين وصهره ثم نتركه يبرد قليلاً ونسقط العينة فيه على
هيئة Block مكعب ثم نشكلها ونوجهها حسب الاتجاه المطلوب وبعد تثبيت بواسطة
طرف دبوس وسرعان ما يتجمد البرافين .

الزيلول الموجود في الخلايا يساعد على تخلل الشمع بين ثنايا الخلايا والأنسجة والعضيات .

-بعد جفاف الشمع نثبته على حامل
mounting وهذا الحامل نضعه في جهاز الميكروتوم microtom وهو عبارة عن جهاز
القطع الرقيق والدقيق لعمل مقاطع وشرائح دقيقة في الخلايا.

عمل مقاطع نسيجية بجهاز الميكروتوم Making tissue section

عند تحريك الحامل ضد الشفرة فإنها
تعمل قطاع دقيق يمكن أن يسقط على الشريحة الزجاجية مباشرة أو قد يسقط في
حوض مليء بالماء حيث يطفو القطاع ومن ثم ندخل الشريحة من تحته حيث يلتصق
بالشريحة الزجاجية . ويكون في هذه الحالة محاط بالشمع ولذلك نضع الشريحة
على طبق ساخن لتجفيف الماء وإزالة فقاعات الهواء . وبعد ذلك يتم وضع
الشريحة في محلول الزيلول لإزالة الشمع ثم نضعها في تراكيز تنازلية من
الكحول 100 إلى 50% لإزالة الزيلول وعمل تجفيف للخلايا ، والأن تكون
الشريحة جاهزة لعملية الصبغ .

الصبغ Staining

الهدف من عملية الصبغ هو ايجاد وتميز
وتمايز بين أجزاء الشيء الواحد ، حيث ان أجزاء الخلية متشابه أو متقارب
الكثافة وغالباً فإن الأشياء المتقاربة الكثافة يصعب التفريق بينها لعدم
وجود خلفيات مميزة فيما بينها أثر سقوط الضوء عليها .

- تعدد الألوان يزيد من نسبة التمايز .

- أطوال موجات الضوء يعطي تمايز للضوء.

- اشهر الصبغات الأيوسين Eosine
والهيموتوكسلين Hematoxilline وعادة تستخدم هاتان الصبغتان معاً بالتعاقب
ويطلق عليها الصبغ المزدوج Double stain .

الأيوسين Eosine :
تتكون من جسيمات سالب الشحنة الكهربائية وهو بذلك يصبغ به السيتوبلازم الذي
له القدرة للصبغ بالصبغات السالب الكهربية لأنه بوجه عام موجبة الكهربية .

الهيموتوكسلين Hematoxilline :
هو يتكون من جسيمات موجبة الشحنة الكهربية وهو بذلك يميل إلى صبغ أجزاء
الخلية السالبة الشحنة الكهربية مثل DNA – RNA – البروتينات الأسيدية
الداخلة في تركيب الكروموزومات وبالتالي فهو يصبغ النواه والكروموزومات
وبهذه الطريقة لنجد السيتوبلازم بلون أحمر وردي أما النواة فإنها تظهر
مزرقة .

- هناك صبغة تعرف باسم سودان أزرق Sudan blue تميل إلى الإرتباط بالمركبات الدهنية وتصبغها باللون الأسود .

- عملية الصبغ ليست فقط للسيتوبلازم والنواة بل يمكن أيضاً صبغ العضيات والجزيئات molecules .

- نلجأ لصبغ الجزيئات بالصبغات الفوسفورية أو الفلوروسينية وقد يضاف غليها الأجسام المضادة .

- يمكن صبغ الجزيئات أيضاً بإضافة
الأنزيمات إلى الخلية الحية التي من شأنها قيام الأنزيمات بتفاعلات أنزيمية
ينشأ عنها منتوجات كثيرة العدد ، لأن كل تفاعل أنزيمي يعطى ناتج وبتكرار
هذه العملية نحصل على العديد من النواتج .

وبالتالي فإن البقعة التي حدث فيها التفاعل الأنزيمي يمكن صبغها وفحصها بالمجهر الضوئي .

- بعد عملية الصبغ يمكن أن تتحلل
القطاعات Deformation لأن عوامل التحلل موجودة في الهواء مثل العوامل
الحيوية التي تمثل في الـ Microorganism أو العوامل الكيميائية مثل الغازات
المختلفة أو الرطوبة .

ولذلك نلجأ إلى حفظ الشريحة من التحلل
بوضع مادة صمغية مثل كندا بلسم – لوكورال ثم نضع غطاء الشريحة الزجاجية
بعناية وتحرك قليلاً لإزالة الفقاعات الهوائية .

ثم نضع الشريحة على Hoot plate لإزالة الماء ولتجفيف الصمغ وبذلك يمكن حفظ الشريحة لمئات السنين .